分光光度計與核酸蛋白檢測
來源:http://www.baguabar.com/   作者:紫外可見分光光度計    更新日期:2018-09-05 04:45:52   

眾所周知,分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。分光光度計的簡單原理:分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源,通過係列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光源透過測試的樣品後,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
 
 

分光光度計與核酸蛋白檢測

核酸的定量
  核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構成不一,因此其換算係數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的係數。如:1OD的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述係數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾後測試空白液和樣品液。然而,實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
 
  事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定範圍內變化,即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩衝液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在幹擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大於0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內,顆粒的幹擾相對較小,結果穩定。
 
  從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試範圍)。最後是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算係數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
 
  除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如 A 260 / A 280的比值,用於評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是 280 nm。純淨的樣品,比值大於 1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低於 1.8 或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A 230表示樣品中存在一些汙染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純淨的核酸 A 260 / A 230 的比值大於 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他幹擾因子。純樣品,A 320 一般是 0。
 
  蛋白質的直接定量(UV法)
  這種方法是在280 nm波長,直接測試蛋白。選擇 Warburg公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。
 
  蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然後直接測試蛋白質。由於緩衝液中存在一些雜質,一般要消除320 nm的“背景”信息,設定此功能“開”。與測試核酸類似,要求 A 280 的吸光值至少大於 0.1A,最佳的線性範圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時,發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上,隻要觀察A 280的吸光值的變化範圍不超過 1%,表明結果非常穩定。
  漂移的原因是因為 Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的係數,隻要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結果很不穩定。
 
  蛋白質直接定量方法,適合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的幹擾,如DNA 的幹擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
 
  比色法蛋白質定量
  蛋白質通常是多種蛋白質的化合物,比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關,從而反應蛋白質濃度。
 
  比色方法一般有 BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
 Lowry 法:以最早期的 Biuret 反應為基礎,並有所改進。蛋白質與Cu2+反應,產生藍色的反應物。但是與 Biuret相比,Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質的影響;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
 BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液裏與Cu2+反應產生 Cu+,後者與 BCA 形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關係極強,反應後形成的化合物非常穩定。相對於 Lowry 法,操作簡單,敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去汙劑的幹擾。
 
 Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應,產生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特點是,敏感度好,是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2倍;操作更簡單,速度更快;隻需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時,方便結果;而且與一係列幹擾 Lowry,BCA 反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對於去汙劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大,無可比性。
 
  某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果並不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由於各種方法反應的基團以及顯色基團不一,所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller 等測試人奶中的蛋白,結果 Lowry,BCA測出的濃度明顯高於Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標準樣品不一致,測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質,以 BSA 作標準品,濃度1.34 mg / ml,以 a 球蛋白作標準品,濃度 2.64 mg /ml。因此,在選擇比色法之前,最好是參照要測試的樣本的化學構成,尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外,比色法定量蛋白質,經常出現的問題是樣品的吸光值太低,導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是,反應後的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應測試時間,所有的樣品(包括標準樣品),都必須在此時間內測試。時間過長,得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯,因為反應後的顏色會讓石英或者玻璃著色,導致樣品吸光值不準確。
 
  細菌細胞密度(OD 600)
 實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液,之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數,做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值,原因是采用了顯色的培養基,即細菌培養一段時間後,與培養基反應,發生變色反應。另外,需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細菌懸浮狀態。


     上海ag俱乐部儀器有限公司是專業提供分光光度計、紫外分光光度計、可見分光光度計、紫外可見分光光度計、超微量分光光度計等光譜分析儀器和實驗室儀器的研發、生產、銷售、服務於一體的高新技術企業,在研發高起點、管理現代化、市場全球化的發展戰略的指引下,將ag俱乐部十幾年豐富的ag俱乐部設計、製造經驗,和多家國際知名分光光度計型號和品牌ag俱乐部的優點相結合,使ag俱乐部得以迅速立足於國內中高檔ag俱乐部的市場,並逐漸向國際市場發展。
  
     以“先”為誌、以“創”為行是ag俱乐部的行動指南,“要做就最好的”是ag俱乐部響亮的口號,打造“精品”為我國的經濟發展做貢獻,也是ag俱乐部的責任。ag俱乐部人就是這樣做的。目前,分光光度計、紫外光度計、可見光度計、紫外可見分光光度計四大係列的ag俱乐部已供應國內外市場。ag俱乐部分光光度計品牌廣泛應用於高校實驗室、科研機構、製藥廠、疾控中心、環保機構、農牧、輕工、電子、醫療、化工、衛生等部門。ag俱乐部秉承創新、專業、可靠的質量方針,以優良的品質,周到的服務,在用戶中樹立起了良好的口碑。ag俱乐部儀器,靠譜的儀器!歡迎垂詢選購!

 

本文由:上海ag俱乐部儀器有限公司整理編輯,版權所有!轉載請注明出處。

 
 
上海ag俱乐部儀器有限公司 主營:分光光度計  紫外可見分光光度計  可見光度計  版權所有 Copyright(C)2005-2020 滬ICP備10016137號-1  網站地圖